Pdcd-4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422152-ACT

Mouse Pdcd4 (programmed cell death 4) kodiert Pdcd-4, ein mit Tumorsuppression assoziiertes RNA-bindendes Protein, das die cap-abhängige Translation reprimiert, indem es die Helikaseaktivität von eIF4A hemmt und die AP-1-abhängige Transkription moduliert. Pdcd-4 integriert Signale aus Wachstumsfaktor- und Entzündungssignalwegen; seine Expression wird häufig durch onkogene Signalwege wie PI3K/AKT/mTOR sowie durch mikroRNA-vermittelte posttranskriptionelle Kontrolle herunterreguliert und beeinflusst dadurch Proliferation, Apoptose und zelluläre Differenzierung. Über diese Mechanismen wird Pdcd-4 häufig in Zusammenhang mit Transformation, metastaseassoziierten Phänotypen und Stressantworten untersucht, ebenso wie in der Immun- und Entzündungsbiologie, in der die Translationskontrolle Zytokinprogramme mitprägt.

Pdcd-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pdcd4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pdcd-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pdcd4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pdcd4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pdcd-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pdcd4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pdcd-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pdcd-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pdcd4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.