Pdcd-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422150-ACT

Das programmierte Zelltodprotein 1 (Pdcd1; PD-1) ist ein inhibitorischer Rezeptor, der überwiegend auf aktivierten T‑Zellen, B‑Zellen und myeloiden Zellpopulationen exprimiert wird, wo er die Antigenrezeptor-Signalübertragung dämpft und die Differenzierung zu Effektorzellen begrenzt. Die Bindung an PD‑1 löst eine Signalübertragung über ein immunrezeptor-tyrosinbasiertes Switch-Motiv aus, die Phosphatasen wie SHP2 rekrutiert und dadurch frühe TCR/CD28-Signalwege einschließlich PI3K–AKT und RAS–MAPK abschwächt, um Zytokinproduktion, Proliferation und metabolische Fitness zu modulieren. Pdcd1 ist ein zentraler Regulator der peripheren Toleranz und der Immunhomöostase, und eine anhaltende Expression ist mit Programmen der T‑Zell-Erschöpfung bei chronischer Entzündung und persistierender Antigenexposition verbunden. In Mausmodellen werden die Expressionsdynamiken von Pdcd1 häufig genutzt, um die Immunregulation in Kontexten wie Infektion, Autoimmunität und Tumorimmunologie zu untersuchen.

Pdcd-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pdcd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pdcd-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pdcd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pdcd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pdcd-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pdcd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pdcd-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pdcd-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pdcd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.