PCSK9 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-430299-ACT-2

Das Mausgen Pcsk9 kodiert die Proproteinkonvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9), eine sezernierte Serinprotease, die die Cholesterinhomöostase reguliert, indem sie den lysosomalen Abbau des LDL-Rezeptors fördert und dadurch die hepatische LDL-Aufnahme moduliert. Die PCSK9-Aktivität ist in SREBP-abhängige Programme der Lipidbiosynthese eingebunden und beeinflusst den systemischen Lipoproteinstoffwechsel; darüber hinaus wurden zusätzliche Funktionen in der inflammatorischen Signalübertragung und in Antworten auf metabolischen Stress beschrieben. Eine dysregulierte Pcsk9/PCSK9-Funktion ist mit Hypercholesterinämie und atherosklerose-relevanten Phänotypen verknüpft, was PCSK9 zu einem häufig genutzten Ziel für mechanistische Untersuchungen der Biologie kardiovaskulärer und metabolischer Erkrankungen macht. Die Geneditierung von Pcsk9 in der Maus ermöglicht eine kontrollierte Beeinflussung des LDLR-Umsatzes und der Lipidverarbeitung zur Aufklärung von Signalwegen, zur in vivo-Krankheitsmodellierung sowie zur Validierung genetischer Modifikatoren, die Plasmalipidmerkmale beeinflussen.

PCSK9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pcsk9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCSK9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pcsk9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pcsk9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCSK9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pcsk9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCSK9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCSK9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pcsk9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.