PCNA CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-400037-ACT-2

Humanes PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine homotrimere, entlang der DNA gleitende Klammer, die als zentrales Gerüst für DNA-Polymerasen sowie zahlreiche Reparatur- und Chromatin-modifizierende Faktoren dient und während der S-Phase die hochprozessive DNA-Synthese koordiniert. Es verknüpft die Replikation mit Mechanismen der DNA-Schadentoleranz und -reparatur, darunter Mismatch-Reparatur, Basenexzisionsreparatur, Nukleotidexzisionsreparatur und transläsionale Synthese; seine Aktivität wird durch posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitinierung und SUMOylierung reguliert, die die Auswahl der Interaktionspartner beeinflussen. Eine fehlregulierte PCNA-Expression oder gestörte Interaktionsnetzwerke sind häufig mit genomischer Instabilität und aberranter Proliferation verbunden, wie sie bei Krebs und anderen mit Replikationsstress verknüpften Pathologien beobachtet werden. In der biomedizinischen Forschung wird PCNA широко als Marker für die Zellzyklusprogression eingesetzt und dient als mechanistischer Zugangspunkt, um die Architektur des Replisoms, die Dynamik von Replikationsgabeln und die Wahl von Reparaturwegen in menschlichen Zellen zu untersuchen.

PCNA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCNA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCNA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCNA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCNA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCNA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCNA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCNA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCNA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCNA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.