PBEF CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425569-ACT

Das Maus-Gen **Nampt** kodiert **PBEF** (auch **Visfatin** genannt), ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym im **NAD⁺-Salvage‑Stoffwechselweg**, das Nicotinamid zu Nicotinamid‑Mononukleotid umwandelt und dadurch den zellulären Energiestoffwechsel sowie die Redoxhomöostase unterstützt. Durch die Kontrolle der NAD⁺‑Verfügbarkeit beeinflusst PBEF sirtuin- und PARP‑abhängige Signalwege, die mitochondriale Funktion, die DNA‑Reparaturkapazität und Stressantworten. Die Aktivität von Nampt/PBEF ist eng mit der immunmetabolischen Regulation, inflammatorischer Signalübertragung und Zellüberlebensprogrammen verknüpft, die Reaktionen bei metabolischer Dysfunktion und tumorassoziierter metabolischer Anpassung prägen. Eine fehlregulierte NAD⁺‑Homöostase unter Beteiligung von Nampt wurde unter anderem im Kontext von Insulinresistenz, neurodegenerationsrelevantem bioenergetischem Stress und proliferativen Krankheitsmodellen untersucht, in denen der NAD⁺‑Bedarf erhöht ist.

PBEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nampt-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PBEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nampt-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nampt-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PBEF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nampt-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PBEF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PBEF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nampt-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.