PBEF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416248-ACT

NAMPT, auch bekannt als PBEF, kodiert die Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im NAD‑Salvage‑Stoffwechselweg, der Nicotinamid in Nicotinamid-Mononukleotid umwandelt. Durch die Kontrolle der intrazellulären NAD‑Verfügbarkeit beeinflusst PBEF die Redoxhomöostase und unterstützt NAD‑abhängige Enzyme, darunter Sirtuine und PARPs, wodurch der metabolische Zustand mit der Chromatinregulation, der DNA‑Reparatur und Stressantworten verknüpft wird. Die NAMPT‑Aktivität überschneidet sich mit mitochondrialer Funktion, inflammatorischer Signalgebung und Zellzykluskontrolle; eine Fehlregulation wurde mit verändertem Immunmetabolismus und Tumorbiologie in Verbindung gebracht. Als multifunktionaler Knotenpunkt im NAD‑Stoffwechsel wird NAMPT häufig im Kontext metabolischer Anpassung, oxidativen Stresses und entzündungsassoziierter zellulärer Phänotypen untersucht.

PBEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NAMPT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PBEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NAMPT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NAMPT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PBEF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NAMPT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PBEF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PBEF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NAMPT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.