Plásmido CRISPR de Activación (h) patched 2: sc-404866-ACT

PTCH2 codifica patched 2, un receptor transmembrana de doce pasos que se une a ligandos Hedgehog y actúa como un regulador negativo clave de la señalización de Smoothened (SMO). Al modular la actividad de los factores de transcripción GLI, PTCH2 contribuye al control de la especificación del destino celular, la proliferación y el patrón tisular durante el desarrollo, con relevancia continua para la homeostasis epitelial en tejidos adultos. La desregulación de la vía Hedgehog, incluidos cambios en la expresión o la función de PTCH2, se ha asociado con un control anómalo del crecimiento y con la biología tumoral en varios contextos tisulares, lo que convierte a PTCH2 en un nodo útil para estudios mecanísticos del reconfigurado de la vía. PTCH2 también ofrece un objetivo accesible para investigar la comunicación cruzada entre la señalización Hedgehog y otros programas reguladores que influyen en la diferenciación y la progresión del ciclo celular.

patched 2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PTCH2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

patched 2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PTCH2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PTCH2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de patched 2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PTCH2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de patched 2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía patched 2 en células tumorales con expresión de PTCH2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.