PAL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408281-ACT

SHCBP1 kodiert das SHC-bindende und spindelassoziierte Protein 1, einen mikrotubuli- und spindelassoziierten Faktor, der an der Mitoseprogression und der Zytokinese beteiligt ist und dessen Funktionen mit der Zentrosomendynamik und der Kontrolle des Zellzyklus verknüpft sind. Die Aktivität von SHCBP1 wird mit proliferativen Signalen stromabwärts von SHC-Adaptorproteinen in Verbindung gebracht und überschneidet sich mit Signalwegen, die Wachstumsfaktor-Signale mit dem Umbau des Zytoskeletts koordinieren. Eine dysregulierte SHCBP1-Expression wurde in mehreren Tumorarten beschrieben und wird häufig im Kontext veränderter Proliferation, chromosomaler Instabilität und invasiver Phänotypen untersucht. In humanen Zellmodellen dient SHCBP1 als nützlicher Knotenpunkt, um Mechanismen zu untersuchen, die mitotische Regulation mit onkogener Signalgebung und Stressantworten koppeln.

PAL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SHCBP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SHCBP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SHCBP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SHCBP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SHCBP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.