PAK4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401895-ACT

PAK4 (quinase 4 ativada por p21) é uma quinase de serina/treonina que atua a jusante das GTPases Cdc42/Rac para coordenar a remodelação do citoesqueleto, a polaridade celular e a dinâmica de adesão. Ela modula a organização da actina e a renovação das adesões focais por meio da fosforilação de substratos que influenciam a sinalização da família Rho, e interage com redes associadas a MAPK e PI3K/AKT que afetam a sobrevivência e a motilidade. Em células humanas, alterações na atividade ou na expressão de PAK4 têm sido associadas à proliferação desregulada, a fenótipos invasivos e à resistência a sinais de estresse em múltiplos contextos de doença. Essas propriedades tornam a PAK4 um alvo útil para estudar sinalização por quinases, programas de migração/invasão e respostas transcricionais a estímulos do citoesqueleto.

PAK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAK4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAK4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAK4 em células tumorais com expressão de PAK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.