PAF-R CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402569-ACT

PTAFR kodiert den Rezeptor für den Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF-R), einen GPCR der Klasse A, der den Plättchen-aktivierenden Faktor bindet und vorwiegend an Gαq/11- und Gαi-Signalwege koppelt, um die Aktivierung der Phospholipase C, den intrazellulären Ca²⁺-Flux sowie nachgeschaltete MAPK- und NF-κB-Transkriptionsprogramme zu regulieren. Die Aktivität von PAF-R verknüpft die Wahrnehmung entzündlicher Lipidmediatoren mit der Chemotaxis von Leukozyten, der Aktivierung des Endothels und der Modulation von Zytokin- und Eicosanoid-Netzwerken und beeinflusst dadurch angeborene Immunantworten und die Gefäßpermeabilität. Eine fehlregulierte PTAFR/PAF-R-Signalgebung wurde mit entzündlichen und allergischen Prozessen, infektionsassoziierter Immunaktivierung sowie der Biologie des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht – unter anderem über Effekte auf das Verhalten myeloider Zellen und die Barrierefunktion. Als Membranrezeptor mit rascher, ligandengesteuerter Signalübertragung stellt er einen gut zugänglichen Angriffspunkt dar, um GPCR-vermittelte Entzündung und das Crosstalk der Lipidsignalgebung zu untersuchen.

PAF-R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTAFR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAF-R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTAFR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTAFR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAF-R-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTAFR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAF-R-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAF-R-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTAFR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.