p68 RNA Helicase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402401-ACT

DDX5 kodiert die p68-RNA-Helikase, eine ATP-abhängige RNA-Helikase der DEAD-Box-Familie, die RNA-Protein-Komplexe umstrukturiert und dadurch das Spleißen von Prä-mRNA, die Ribosomenbiogenese, den RNA-Export und die MikroRNA-Prozessierung reguliert. p68 fungiert zudem als transkriptioneller Ko-Regulator, indem es mit Faktoren wie p53, β-Catenin und ERα interagiert und so den RNA-Stoffwechsel mit der Zellzykluskontrolle und stressresponsiven Programmen der Genexpression verknüpft. Über diese Aktivitäten ist DDX5 an Signalwegen beteiligt, die die RNA-Prozessierung mit Chromatin- und Transkriptionsdynamik koordinieren, und beeinflusst damit Proliferation, Differenzierung und DNA-Schadensantworten. Eine fehlregulierte DDX5-Expression oder -Aktivität wurde mit veränderter onkogener Signalübertragung und aberranten Signaturen der RNA-Prozessierung in verschiedenen Tumorkontexten in Verbindung gebracht, was seine Verwendung als mechanistischen Knotenpunkt in krankheitsrelevanten Studien zur Genregulation unterstützt.

p68 RNA Helicase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDX5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p68 RNA Helicase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDX5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDX5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p68 RNA Helicase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDX5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p68 RNA Helicase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p68 RNA Helicase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDX5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.