p68 RNA Helicase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402401-ACT

DDX5 codifica per l’elicasi dell’RNA p68, un’elicasi dell’RNA ATP-dipendente della famiglia DEAD-box che rimodella i complessi RNA–proteina per regolare lo splicing del pre-mRNA, la biogenesi dei ribosomi, l’esportazione dell’RNA e la maturazione dei microRNA. p68 funziona anche come co-regolatore trascrizionale interagendo con fattori quali p53, β-catenina ed ERα, collegando il metabolismo dell’RNA al controllo del ciclo cellulare e a programmi di espressione genica sensibili allo stress. Attraverso queste attività, DDX5 partecipa a vie che coordinano l’elaborazione dell’RNA con la dinamica della cromatina e della trascrizione, influenzando proliferazione, differenziamento e risposte al danno al DNA. Un’espressione o un’attività deregolata di DDX5 è stata associata a un’alterazione della segnalazione oncogenica e a firme aberranti di processamento dell’RNA osservate in molteplici contesti tumorali, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in studi di regolazione genica rilevanti per la malattia.

p68 RNA Helicase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDX5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p68 RNA Helicase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDX5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDX5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p68 RNA Helicase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDX5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p68 RNA Helicase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p68 RNA Helicase nelle cellule tumorali con espressione di DDX5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.