P5CR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410971-ACT

Humanes PYCR1 kodiert die Pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase 1 (P5CR), ein mitochondriales Enzym, das im letzten Schritt der Prolinbiosynthese die NAD(P)H-abhängige Reduktion von Pyrrolin-5-carboxylat zu Prolin katalysiert. Über die Kopplung an den Glutamat- und Ornithinstoffwechsel unterstützt PYCR1 die Redoxhomöostase, die Verfügbarkeit von Aminosäuren und die mitochondriale Funktion, mit nachgelagerten Effekten auf die Proteostase und die Biologie der extrazellulären Matrix. Eine veränderte PYCR1-Aktivität wurde mit Bindegewebsphänotypen und metabolischen Stressantworten in Verbindung gebracht, und eine Dysregulation des Prolinstoffwechsels wird häufig in Kontexten wie oxidativem Stress-Signaling, kollagenreichen Mikroumgebungen und proliferativem Remodeling untersucht. Diese Eigenschaften machen PYCR1 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie mitochondrialer Stoffwechsel und Redoxgleichgewicht den Zellzustand und die Stressadaptation prägen.

P5CR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PYCR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P5CR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PYCR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PYCR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P5CR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PYCR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P5CR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P5CR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PYCR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.