p55 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409649-ACT

Das humane MPP1-Gen kodiert das membranpalmitoylierte Protein p55, einen Gerüstfaktor der MAGUK-Familie, der zur Organisation membranassoziierter Proteinkomplexe beiträgt und diese mit dem kortikalen Aktin‑Spektrin-Zytoskelett koppelt. p55 ist über Interaktionen mit FERM-Domänen-Proteinen und weiteren Zytoskelett-Adaptern an der Stabilität von Zellkontakten und an der Architektur von Membrandomänen beteiligt und beeinflusst dadurch Zellform, Polarität und Trafficking. In Erythrozyten trägt MPP1 zur mechanischen Integrität der Membran und zur Organisation spezialisierter Mikrodomainen bei – Prozesse, die für die Deformierbarkeit roter Blutkörperchen und Membranstabilitäts-Phänotypen relevant sind. Veränderte, p55-abhängige Gerüstbildung wurde in Kontexten untersucht, in denen die Verankerung am Zytoskelett und die Regulation von Zell‑Zell-Kontakten gestört sind, und bietet damit einen Rahmen zur Untersuchung der Membranorganisation in normalen sowie krankheitsassoziierten Zuständen.

p55 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MPP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p55 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MPP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MPP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p55-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MPP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p55-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p55-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MPP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.