Plasmide CRISPR d'Activation (m) p54/nrb: sc-424729-ACT

Le gène murin **Nono** code p54/nrb (NONO), une protéine nucléaire multifonctionnelle se liant à l’ARN et à l’ADN, qui se localise dans les paraspeckles et participe à la régulation transcriptionnelle, à l’épissage du pré-ARNm et au traitement des ARN. p54/nrb forme des complexes avec d’autres membres de la famille DBHS afin de coordonner des programmes d’expression génique, et peut influencer les réponses aux dommages de l’ADN via des rôles dans la réparation des cassures double brin et le maintien de la stabilité génomique. Par ces activités, NONO contribue au contrôle de la progression du cycle cellulaire, à la transcription adaptative au stress et à l’architecture nucléaire. La dérégulation des réseaux de régulation des ARN associés à NONO a été reliée dans la littérature à une altération des signaux prolifératifs et à des états d’expression génique aberrants pertinents pour la biologie du cancer et les mécanismes des maladies neurologiques.

p54/nrb Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nono sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p54/nrb Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nono dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nono, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p54/nrb. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nono natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p54/nrb au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p54/nrb dans les cellules tumorales présentant une expression de Nono silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.