P2Y1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422095-ACT

Das Mausgen **P2ry1** kodiert den purinergen Rezeptor **P2Y1**, einen durch extrazelluläres ADP aktivierten G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der vorwiegend an **Gq/11** koppelt und dadurch die **Phospholipase‑C‑Signalgebung**, die **Inositolphosphat‑Produktion** sowie die **Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+** stimuliert. P2Y1 trägt zur purinergen Neurotransmission, zu thrombocytenähnlichen Aggregationswegen, zur Regulation des Gefäßtonus und zur Aktivierung von Immunzellen bei, indem es die Nukleotidfreisetzung mit nachgeschalteten Second‑Messenger‑Netzwerken integriert. Durch Crosstalk mit **MAPK**‑ und anderen calciumabhängigen Signalwegen moduliert P2Y1 Sekretion, Migration und Erregbarkeit in unterschiedlichen Geweben. Eine dysregulierte purinerge Signalgebung unter Beteiligung von P2Y1 wurde mit Thrombose‑ und hämostasebezogenen Phänotypen, entzündlichen Reaktionen und neurovaskulären Funktionsstörungen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für mechanistische Krankheitsmodelle unterstreicht.

P2Y1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P2ry1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P2Y1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P2ry1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P2ry1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P2Y1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P2ry1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P2Y1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P2Y1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P2ry1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.