P23 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402670-ACT

Das humane PTGES3 kodiert p23, einen konservierten HSP90-Ko-Chaperon, der Klientenprotein-Komplexe stabilisiert und den ATPase-Zyklus moduliert, um die Proteinreifung und Signaltransduktion zu unterstützen. p23 ist vor allem dafür bekannt, den Zusammenbau von Steroidhormonrezeptoren und deren nukleare Signalgebung zu regulieren; zudem ist es an umfassenderen Proteostase-Netzwerken beteiligt, die zelluläre Stressantworten und die Transkriptionskontrolle beeinflussen. Durch die Einbindung in chaperonabhängige Signalwege kann PTGES3 die zelluläre Proliferation, Differenzierung und adaptive Reaktionen auf proteotoxischen Stress mitsteuern. Ein verändertes Gleichgewicht von Chaperonen und Ko-Chaperonen sowie eine fehlregulierte Rezeptorsignalgebung wurden mit krankheitsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter in der Krebsbiologie und in entzündlichen Signalzusammenhängen, wodurch PTGES3 ein geeigneter Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen ist.

P23 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTGES3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P23 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTGES3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTGES3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P23-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTGES3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P23-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P23-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTGES3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.