ORMDL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403585-ACT

ORMDL2 (Orosomucoid-like 2) ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das zur Homöostase der Sphingolipide beiträgt, indem es die Aktivität der Serin-Palmitoyltransferase moduliert und die Synthese von Ceramid und Sphingomyelin ausbalanciert. Über diese Funktion beeinflusst ORMDL2 die Zusammensetzung der ER-Membran, den Calciumhaushalt und die ER-Stress-Signalgebung und verknüpft damit den Lipidstoffwechsel mit Proteostase und entzündlichen Antworten. Eine veränderte Regulation der ORMDL-Familie wurde mit Entzündungen der Atemwege, asthmaassoziierten Merkmalen und breiteren immunometabolischen Phänotypen in Zusammenhang gebracht, was ORMDL2 zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung lipidgetriebener Signalwege in menschlichen Zellen macht. Seine Position an der Schnittstelle zwischen Sphingolipid-Biosynthese und Stressantwortwegen unterstützt mechanistische Forschung dazu, wie der ER-Lipidfluss angeborene Immun- und Barrierefunktionen prägt.

ORMDL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ORMDL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ORMDL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ORMDL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ORMDL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ORMDL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ORMDL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ORMDL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ORMDL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ORMDL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.