Orexin-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400357-ACT

Das humane **HCRT**-Gen kodiert **Prepro-Orexin**, das proteolytisch verarbeitet wird und dabei **Orexin-A** erzeugt – ein Neuropeptid, das vor allem über **OX1R** und **OX2R** (HCRTR1/HCRTR2) signalisiert und so Wachheit, die Stabilität des Schlaf-Wach-Rhythmus, Fressverhalten, Belohnungsverarbeitung sowie die autonome Homöostase reguliert. Orexin-A aktiviert GPCR-vermittelte Signalwege, darunter **Gq/11**- und **Gi/o**-gekoppelte Signalübertragung, und moduliert dadurch die intrazelluläre Kalziumdynamik, die **MAPK/ERK**-Aktivität und die neuronale Erregbarkeit in hypothalamischen und hirnstammbezogenen Schaltkreisen. Eine Fehlregulation der Orexin-Signalübertragung ist eng mit Schlafstörungen wie **Narkolepsie** sowie mit breiteren Phänotypen verbunden, die den Stoffwechselhaushalt und die Stressreaktivität betreffen. In der biomedizinischen Forschung wird **HCRT/Orexin-A** genutzt, um die Funktion neuromodulatorischer Netzwerke, die schaltkreisweite Integration des Energiestatus und Transkriptionsprogramme zu untersuchen, die mit Wachheit und Motivation assoziiert sind.

Orexin-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HCRT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Orexin-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HCRT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HCRT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Orexin-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HCRT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Orexin-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Orexin-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HCRT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.