OPN1LW CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417309-ACT

OPN1LW kodiert das langwelligkeitssensitive Opsin (L-Zapfen-Opsin), ein GPCR-ähnliches Fotopigment, das in retinalen Zapfen-Photorezeptoren exprimiert wird und als Antwort auf rotes Licht die Phototransduktion einleitet. Nach der Photonabsorption und Isomerisierung von 11-cis-Retinal aktiviert OPN1LW die Transducin–PDE6-Kaskade, senkt den cGMP-Spiegel, schließt zyklisch-nukleotidgesteuerte Kanäle und moduliert so Membranpotenzial und synaptische Signalübertragung in der visuellen Bahn. Seine Expression wird durch zapfenspezifische Transkriptionsprogramme und den Chromatinkontext innerhalb des Opsin-Genclusters auf Xq28 streng reguliert, was zur spektralen Abstimmung und zur Identität von Zapfen-Subtypen beiträgt. Varianten und eine fehlregulierte Expression von OPN1LW sind mit erblichen Farbsehstörungen und Zapfen-Photorezeptor-Dysfunktionen assoziiert und bieten einen molekularen Ansatzpunkt zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in der menschlichen Sehbiologie.

OPN1LW Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OPN1LW-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OPN1LW Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OPN1LW-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OPN1LW-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OPN1LW-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OPN1LW-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OPN1LW-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OPN1LW-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OPN1LW-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.