OPA1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428749-ACT

Das murine Gen **Opa1** kodiert die mitochondriale, dynaminähnliche GTPase **OPA1**, einen zentralen Regulator der Fusion der inneren Mitochondrienmembran und der Cristae-Architektur. Durch die Kontrolle der Integrität der Cristae-Junctions trägt OPA1 dazu bei, die Effizienz der oxidativen Phosphorylierung, die Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA und die Kompartimentierung von Cytochrom c zu regulieren und beeinflusst damit die Anfälligkeit für die intrinsische Apoptose. Die OPA1-Funktion ist eng mit mitochondrialen Qualitätskontrollwegen gekoppelt, einschließlich der OMA1/YME1L-abhängigen proteolytischen Prozessierung, die unter Stress das Gleichgewicht zwischen langen und kurzen OPA1-Isoformen ausbalanciert. Eine veränderte OPA1-Aktivität wird häufig als mechanistischer Einstiegspunkt genutzt, um Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion zu untersuchen, die für Neurodegeneration, Optikusneuropathie und kardio-metabolische Stressmodelle relevant sind.

OPA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Opa1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OPA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Opa1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Opa1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OPA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Opa1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OPA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OPA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Opa1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.