Plasmide CRISPR d'Activation (h) OCT2: sc-402053-ACT

SLC22A2 code le transporteur de cations organiques 2 (OCT2), un transporteur de solutés polyspecific (famille des SLC) qui médie l’entrée électrogénique d’amines endogènes et de cations organiques xénobiotiques à travers la membrane plasmique. Chez l’humain, OCT2 est particulièrement important pour le transport au niveau du tubule proximal rénal, où il contribue à la sécrétion vectorielle et à l’exposition cellulaire aux composés transportés, influençant leur devenir intracellulaire ainsi que les réponses mitochondriales ou liées au stress oxydatif. L’activité d’OCT2 s’inscrit aussi dans des réseaux plus larges de détoxification et de pharmacocinétique en modulant la disponibilité des substrats pour le métabolisme de phase I/II et pour les transporteurs d’efflux. Des variations ou une dérégulation de SLC22A2 ont été associées à des différences interindividuelles dans la prise en charge des médicaments et à la susceptibilité aux toxicités médiées par les transporteurs, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques en biologie rénale et épithéliale.

OCT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC22A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OCT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC22A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC22A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OCT2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC22A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OCT2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OCT2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC22A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.