NT-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402291-ACT

Das humane NTF4-Gen kodiert Neurotrophin-4 (NT-4), einen sezernierten Wachstumsfaktor, der vor allem über NTRK2/TrkB und mit geringerer Affinität über NGFR/p75NTR signalisiert und so neuronales Überleben, Differenzierung und die Aufrechterhaltung synaptischer Strukturen reguliert. Die Bindung von NT-4 an TrkB aktiviert nachgeschaltete PI3K–AKT-, MAPK/ERK- und PLCγ-Signalwege und unterstützt damit Neuritenauswuchs sowie aktivitätsabhängige Plastizität im zentralen und peripheren Nervensystem. Über die Neurobiologie hinaus beeinflussen die NTF4-Expression und die Aktivität des TrkB-Signalwegs zelluläre Stressantworten und trophische Unterstützungsprogramme, die mit Degeneration und maladaptivem Remodeling verknüpft sind. Eine dysregulierte Neurotrophin-/TrkB-Signalgebung wurde u. a. im Zusammenhang mit neurodegenerativen Prozessen, Mechanismen neuropathischer Schmerzen und Interaktionen zwischen Tumorzellen und Mikroumgebung untersucht, bei denen die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren Proliferations- und Überlebensphänotypen prägen kann.

NT-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NTF4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NT-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NTF4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NTF4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NT-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NTF4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NT-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NT-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NTF4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.