Plasmide CRISPR d'Activation (h) NSF: sc-402258-ACT

NSF (N-ethylmaleimide–sensitive factor) code une ATPase AAA+ qui dissocie les complexes cis-SNARE après la fusion membranaire, régénérant ainsi les SNAREs pour des cycles répétés de transport vésiculaire. Cette activité est au cœur du trafic intracellulaire, notamment l’exocytose, l’endocytose et le cycle des vésicules synaptiques, et elle soutient la dynamique des organites dans les voies sécrétoire et endolysosomale. En contrôlant l’efficacité de l’amarrage et de la fusion des vésicules, NSF influence la neurotransmission, la sécrétion et le renouvellement des protéines membranaires, des processus souvent perturbés dans des troubles neurologiques et d’autres pathologies où la protéostasie et le trafic sont altérés. Une dérégulation de la machinerie de fusion vésiculaire peut modifier la signalisation cellulaire et les réponses au stress, faisant de NSF un nœud pertinent pour des études mécanistiques des phénotypes liés au trafic membranaire.

NSF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NSF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NSF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NSF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NSF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NSF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NSF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NSF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NSF dans les cellules tumorales présentant une expression de NSF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.