NRAMP 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418176-ACT

Das humane Gen **SLC11A2** kodiert **NRAMP2** (auch bekannt als **DMT1**), einen protonengekoppelten Transporter für zweiwertige Metalle, der die zelluläre Aufnahme von zweiwertigem Eisen (Fe²⁺) und anderen Übergangsmetallen über endosomale und Plasmamembranen vermittelt. Durch die Steuerung des Eiseneinstroms aus transferrinhaltigen Endosomen sowie aus der diätetischen Resorption trägt NRAMP2 dazu bei, die zytosolische Eisenverfügbarkeit für die Hämsynthese, die mitochondriale Atmung und die Biogenese von Eisen‑Schwefel‑Clustern aufrechtzuerhalten und beeinflusst zugleich das Redoxgleichgewicht. Eine Störung der SLC11A2-Aktivität verändert die Eisenhomöostase und die Signalwege des oxidativen Stresses; dies ist nachweislich relevant für Erkrankungen des Eisenstoffwechsels wie mikrozytäre Anämie und Phänotypen systemischer Eisenüberladung. Die Funktion von NRAMP2 wird außerdem im Kontext der Metallhandhabung in Makrophagen sowie der neuronalen Vulnerabilität untersucht, die mit eisenabhängigem zellulärem Stress verknüpft ist.

NRAMP 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC11A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NRAMP 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC11A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC11A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NRAMP 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC11A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NRAMP 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NRAMP 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC11A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.