NRAMP 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418176-ACT

SLC11A2 umano codifica NRAMP2 (noto anche come DMT1), un trasportatore di metalli bivalenti accoppiato ai protoni che media l’ingresso cellulare del ferro ferroso e di altri metalli di transizione attraverso le membrane endosomiale e plasmatica. Controllando l’afflusso di ferro dagli endosomi contenenti transferrina e dalle vie di assorbimento dietetico, NRAMP2 contribuisce a mantenere la disponibilità di ferro citosolico per la sintesi dell’eme, la respirazione mitocondriale e la biogenesi dei cluster ferro-zolfo, influenzando al contempo l’equilibrio redox. Alterazioni dell’attività di SLC11A2 modificano l’omeostasi del ferro e la segnalazione legata allo stress ossidativo, con una rilevanza documentata per disturbi del metabolismo del ferro come l’anemia microcitica e fenotipi di sovraccarico sistemico di ferro. La funzione di NRAMP2 è inoltre studiata nel contesto della gestione dei metalli nei macrofagi e della vulnerabilità neuronale associata a stress cellulare dipendente dal ferro.

NRAMP 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC11A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NRAMP 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC11A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC11A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NRAMP 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC11A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NRAMP 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NRAMP 2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC11A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.