NRAMP 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402423-ACT

SLC11A1 kodiert NRAMP1 (natural resistance–associated macrophage protein 1), einen Transporter für zweiwertige Metallionen, der in myeloiden Zellen überwiegend mit phagosomalen Membranen assoziiert ist. Durch die Regulation der intraphagosomalen Verfügbarkeit von Fe²⁺ und Mn²⁺ beeinflusst NRAMP1 metallabhängige antimikrobielle Antworten, den Umgang mit oxidativem Stress sowie die Reifung von Phagolysosomen. Diese Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen der angeborenen Immunität und Antigenverarbeitungswegen, die Aktivierungszustände von Makrophagen und die inflammatorische Ausgabe prägen. Genetische Variation oder eine veränderte Expression von SLC11A1 wurde mit unterschiedlicher Anfälligkeit für infektiöse und entzündliche Phänotypen in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien im Bereich Immunmetabolismus und Wirt–Pathogen-Biologie macht.

NRAMP 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC11A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NRAMP 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC11A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC11A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NRAMP 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC11A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NRAMP 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NRAMP 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC11A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.