NPT2b CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-423004-ACT-2

Das Mausgen Slc34a2 kodiert das natriumabhängige Phosphat-Transportprotein NPT2b (SLC34A2), einen membranständigen Kotransporter, der die Na⁺-gekoppelte Aufnahme von anorganischem Phosphat über epitheliale Oberflächen vermittelt und zur systemischen Phosphathomöostase beiträgt. Die Aktivität von NPT2b verknüpft die extrazelluläre Phosphatverfügbarkeit mit dem zellulären Phosphorstoffwechsel und Signalprogrammen, die vom Phosphatfluss abhängen, einschließlich epithelialer Transportprozesse und mineralisierungsbezogener Signalwege. Eine veränderte SLC34A2-Funktion ist mit einer gestörten Phosphatverarbeitung assoziiert und wurde mit Epithelpathologien in Verbindung gebracht, insbesondere mit der pulmonalen alveolären Mikrolithiasis infolge einer beeinträchtigten Phosphat-Clearance in der Lunge. Genetische Eingriffe in Slc34a2 in Mausmodellen unterstützen mechanistische Untersuchungen zum epithelialen Ionentransport, zu phosphatregulierten Gennetzwerken sowie zu gewebespezifischen Folgen einer Phosphatdysregulation in den Atemwegen und anderen Epithelien.

NPT2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc34a2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPT2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc34a2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc34a2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPT2b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc34a2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPT2b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPT2b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc34a2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.