Plasmide CRISPR d'Activation (h) NPRL2: sc-402875-ACT

Le NPRL2 humain code un composant central du complexe GATOR1, un régulateur négatif majeur de la signalisation mTORC1 qui relie la disponibilité en acides aminés au contrôle de la croissance cellulaire. En favorisant la limitation de l’activité de mTORC1, NPRL2 soutient les réponses au stress nutritionnel, la régulation de l’autophagie et l’homéostasie métabolique, influençant la synthèse protéique et la progression du cycle cellulaire. Des altérations de l’expression ou de la fonction de NPRL2 ont été associées à une dérégulation de l’activité de la voie mTOR observée dans divers contextes de prolifération aberrante et d’adaptation au stress, ce qui en fait une cible pertinente pour les études mécanistiques du contrôle de la croissance. NPRL2 est également utilisé comme nœud pour analyser les circuits de détection des nutriments et les programmes transcriptionnels en aval qui façonnent la survie cellulaire et la capacité biosynthétique.

NPRL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPRL2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPRL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPRL2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPRL2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPRL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPRL2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPRL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPRL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPRL2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.