Notch1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400167-ACT

Das humane Gen **NOTCH1** kodiert den transmembranen Rezeptor Notch1, einen zentralen Vermittler der juxtakrinen Notch-Signalübertragung, der während der Entwicklung und der Gewebehomöostase Zellschicksalsentscheidungen, Proliferation und Differenzierung steuert. Die Ligandenbindung löst eine proteolytische Prozessierung und die Freisetzung der intrazellulären Notch-Domäne aus, die in den Zellkern transloziert und dort Transkriptionsprogramme reguliert, welche die Linienfestlegung sowie die Aufrechterhaltung von Stamm- und Vorläuferzellen kontrollieren. Die Notch1-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen wie **WNT/β-Catenin**, **NF-κB**, **PI3K–AKT** und **TGF-β**, um kontextabhängige transkriptionelle Outputs zu koordinieren. Eine fehlregulierte NOTCH1-Signalgebung ist mit der Krebsbiologie, der Entwicklung von Immunzellen sowie kardiovaskulären und neuroentwicklungsbezogenen Prozessen assoziiert und unterstreicht damit ihre breite Relevanz für mechanistische Studien.

Notch1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOTCH1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Notch1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOTCH1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOTCH1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Notch1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOTCH1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Notch1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Notch1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOTCH1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.