NMNAT-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403839-ACT

NMNAT3 kodiert die Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase 3 (NMNAT-3), ein Schlüsselenzym der NAD-Biosynthese, das die Umwandlung von NMN und ATP zu NAD katalysiert. In menschlichen Zellen ist NMNAT-3 vor allem mit der Aufrechterhaltung des mitochondrialen NAD-Pools assoziiert und steht damit in Zusammenhang mit der Redox-Homöostase, der oxidativen Phosphorylierung und der metabolischen Anpassung unter Stress. Indem NMNAT-3 die Verfügbarkeit von NAD mitprägt, beeinflusst es sirtuin- und PARP-abhängige Signalwege, die mitochondriale Widerstandsfähigkeit sowie zelluläre Antworten auf oxidativen Schaden. Eine Fehlregulation des NAD-Stoffwechsels und mitochondriale Dysfunktion bringen die NMNAT3-bezogene Biologie in Studien zu Neurodegeneration, kardiometabolischem Stress und altersassoziierten Rückgängen des Energiestoffwechsels in den Fokus.

NMNAT-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NMNAT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NMNAT-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NMNAT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NMNAT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NMNAT-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NMNAT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NMNAT-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NMNAT-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NMNAT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.