NMNAT-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403085-ACT

NMNAT1 kodiert die Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase 1 (NMNAT-1), ein nukleäres Enzym, das den letzten Schritt der NAD⁺-Biosynthese aus NMN und ATP katalysiert. Durch die Aufrechterhaltung nukleärer NAD⁺-Pools unterstützt NMNAT-1 NAD⁺-abhängige Prozesse, darunter PARP-vermittelte DNA-Schadensantworten, sirtuinregulierte Chromatindynamik sowie übergeordnete metabolische Signalwege, die Genomstabilität mit zellulärer Anpassung an Stress verknüpfen. Eine veränderte NMNAT1-Funktion wurde mit retinalen und neurodegenerativen Phänotypen in Zusammenhang gebracht und wird häufig in Kontexten untersucht, in denen die NAD⁺-Homöostase die Zellviabilität unter genotoxischem oder oxidativem Stress beeinflusst. Daher ist NMNAT1 für die Forschung zu NAD⁺-Stoffwechsel, nukleärem Redoxgleichgewicht und dem Crosstalk zwischen DNA-Reparatur und transkriptioneller Regulation relevant.

NMNAT-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NMNAT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NMNAT-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NMNAT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NMNAT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NMNAT-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NMNAT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NMNAT-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NMNAT-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NMNAT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.