NIF-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412963-ACT

Humanes ZNF335 kodiert NIF-1, ein nukleäres Zinkfingerprotein, das als chromatinassoziierter Regulator der Transkription und genomeweiter Genexpressionsprogramme fungiert. NIF-1 wird mit der Kontrolle der Proliferation und Differenzierung neuraler Vorläuferzellen in Verbindung gebracht, indem es epigenetische und transkriptionelle Netzwerke koordiniert, die entwicklungsrelevante Gensätze prägen. Durch die Beeinflussung des Chromatinzustands und der Promotoraktivität greift ZNF335/NIF-1 in Signalwege ein, die den Zellzyklus, die Festlegung von Zellschicksalen und die Aufrechterhaltung der zellulären Identität steuern. Eine fehlregulierte Expression oder Funktion von ZNF335 wurde mit neuroentwicklungsbedingten Auffälligkeiten assoziiert und bietet einen mechanistischen Ansatzpunkt, um die transkriptionelle Kontrolle in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

NIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZNF335-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZNF335-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZNF335-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZNF335-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZNF335-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.