NFKBIA/IkB alpha CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400034-ACT

NFKBIA kodiert IκBα, einen zentralen zytoplasmatischen Inhibitor von NF-κB, der an RELA/p50‑Komplexe bindet und unter Basalbedingungen deren Translokation in den Zellkern begrenzt. Nach Stimulation durch Zytokine, Toll‑like‑Rezeptor‑Liganden oder Stresssignale wird IκBα durch den IKK‑Komplex phosphoryliert, ubiquitiniert und abgebaut, wodurch eine rasche NF‑κB‑abhängige Transkription von Entzündungs‑, Immun‑ und Überlebensprogrammen ermöglicht wird. NFKBIA ist zudem an der negativen Rückkopplung beteiligt, da es selbst ein NF‑κB‑Zielgen ist und so hilft, die Signalwegaktivität nach einer Stimulation wieder zurückzusetzen. Eine dysregulierte NFKBIA‑Expression oder ein veränderter IκBα‑Umsatz wurde mit chronischer Entzündung, Immundysregulation und NF‑κB‑getriebener Tumorbiologie in Verbindung gebracht, wodurch es in Studien zur angeborenen Signalübertragung und zu Zellschicksalsentscheidungen einen häufig untersuchten Knotenpunkt darstellt.

NFKBIA/IkB alpha Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NFKBIA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NFKBIA/IkB alpha Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NFKBIA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NFKBIA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NFKBIA/IkB alpha-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NFKBIA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NFKBIA/IkB alpha-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NFKBIA/IkB alpha-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NFKBIA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.