Neutrophil Elastase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400677-ACT

ELANE kodiert die neutrophile Elastase, eine Serinprotease, die in azurophilen Granula gespeichert wird und während der Degranulation sowie der Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) freigesetzt wird, um die extrazelluläre Matrix umzubauen und mikrobielle wie auch körpereigene Proteine abzubauen. Ihre Aktivität trägt zur angeborenen Immunsignalgebung bei, indem sie Chemokingradienten formt und Entzündungsmediatoren moduliert, wobei sie durch endogene Antiproteasen streng reguliert wird, um Kollateralschäden am Gewebe zu verhindern. Eine dysregulierte Expression oder Aktivität der neutrophilen Elastase wird mit entzündlich bedingten Gewebeschäden und veränderten Wirt–Pathogen-Interaktionen in Verbindung gebracht, und ELANE-Varianten wurden mit erblichen Neutropänie-Phänotypen verknüpft, die die Granulopoese beeinträchtigen. Daher wird ELANE häufig in Modellen zur myeloischen Differenzierung, zum Protease–Antiprotease-Gleichgewicht und zur entzündlichen Pathologie untersucht.

Neutrophil Elastase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ELANE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neutrophil Elastase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ELANE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ELANE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neutrophil Elastase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ELANE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neutrophil Elastase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neutrophil Elastase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ELANE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.