nestin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400156-ACT

O NES humano codifica a nestina, uma proteína de filamento intermediário da classe VI enriquecida em células-tronco/progenitoras neurais e outros precursores multipotentes, nas quais dá suporte à organização do citoesqueleto durante a rápida proliferação, migração e compromisso de linhagem. A expressão de nestina está estreitamente ligada a programas de desenvolvimento e ao remodelamento responsivo ao estresse, interagindo com redes de sinalização como Notch, Wnt/β-catenina e vias de fatores de crescimento que regulam a “stemness” e a diferenciação. Em tecidos adultos, o NES é frequentemente induzido durante lesão e regeneração, refletindo papéis em glia reativa, angiogênese e remodelamento tecidual. A expressão desregulada de nestina é frequentemente usada como marcador de estados pouco diferenciados e tem sido associada à plasticidade e à invasividade de células tumorais em múltiplos contextos de câncer.

nestin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NES sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nestin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NES em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NES, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nestin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NES nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nestin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nestin em células tumorais com expressão de NES silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.