nephrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400368-ACT

NPHS1 kodiert Nephrin, ein transmembranöses Protein der Immunglobulin-Superfamilie, das eine zentrale Komponente der Schlitzmembran (slit diaphragm) von Podozyten bildet und für die glomeruläre Filtrationsbarriere essenziell ist. Nephrin ist an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt und organisiert über Interaktionen mit Adapterproteinen wie NCK Signalplattformen, wodurch die extrazelluläre Architektur der Schlitzmembran mit dem Umbau des Aktin-Zytoskeletts sowie PI3K/AKT-assoziierten Signalwegen verknüpft wird. Eine Störung der NPHS1-Expression oder des Nephrin-Transports beeinträchtigt die Podozytenstruktur und erhöht die Permeabilität, was NPHS1 zu einem zentralen molekularen Knotenpunkt in Studien zu Mechanismen proteinurischer Nierenerkrankungen macht. In Modellen der menschlichen Nierenbiologie wird NPHS1 routinemäßig eingesetzt, um den Differenzierungszustand von Podozyten, die Integrität der Filtrationsbarriere und Stressantworten zu untersuchen, die auf die Regulation von Zytoskelett und Zellkontakten zusammenlaufen.

nephrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPHS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

nephrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPHS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPHS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen nephrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPHS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von nephrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des nephrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPHS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.