NELF-B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405667-ACT

Das humane Gen **NELFB** kodiert **NELF-B**, eine zentrale Untereinheit des **Negative Elongation Factor (NELF)**-Komplexes, der mit **DSIF** zusammenwirkt, um ein promoter-nahes Pausieren der **RNA-Polymerase II** durchzusetzen und die frühe Phase der Transkriptionselongation zu prägen. Durch die Regulation der Pausenfreisetzung und der Transkriptionskinetik beeinflusst NELF-B stimulusabhängige Genprogramme, die Enhancer–Promoter-Kommunikation sowie eine umfassendere, chromatinverknüpfte Kontrolle der Genexpression. NELF-abhängiges Pausieren ist eng mit Signalwegen verbunden, die den Zellzyklus, die Differenzierung und Stressantworten steuern, wodurch die Funktion von NELFB für mechanistische Studien zur Transkriptionsdysregulation relevant ist. Eine veränderte Regulation der Elongationskontrolle wurde in vielfältigen Krankheitskontexten beschrieben, was den Einsatz von NELFB-Perturbationen unterstützt, um zu modellieren, wie Pausendynamiken nachgelagerte Phänotypen beeinflussen.

NELF-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NELFB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NELF-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NELFB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NELFB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NELF-B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NELFB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NELF-B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NELF-B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NELFB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.