Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nek1: sc-403501-ACT

NEK1 code la kinase 1 apparentée à NIMA (Nek1), une kinase sérine/thréonine impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire, la biologie du centrosome et des cils, ainsi que la coordination de la réponse aux dommages de l’ADN. Nek1 a été associée à des processus de signalisation qui régulent la dynamique des microtubules, la signalisation des points de contrôle et la stabilité du génome via un contrôle dépendant de la phosphorylation de substrats mitotiques clés et de substrats impliqués dans la réparation. Dans les cellules humaines, une activité altérée de NEK1 est associée à des défauts de ciliogenèse et à une réponse diminuée au stress génotoxique, reliant cette kinase à des voies qui façonnent l’homéostasie cellulaire. Des études génétiques et fonctionnelles ont également impliqué NEK1 dans des mécanismes pertinents pour la maladie, notamment la neurodégénérescence et des phénotypes d’instabilité du génome liés au cancer.

Nek1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nek1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nek1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nek1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nek1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NEK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.