Plasmide CRISPR d'Activation (h) NEDD8: sc-417924-ACT

NEDD8 code la protéine de type ubiquitine NEDD8, un modificateur essentiel de la voie de neddylation, qui se conjugue de manière covalente aux protéines d’échafaudage de la famille des cullines afin d’activer les ligases E3 ubiquitine culline–RING (CRL). En régulant l’ubiquitination dépendante des CRL, NEDD8 influence la protéostasie, la progression du cycle cellulaire, la réplication et la réparation de l’ADN, ainsi que la signalisation des réponses au stress. L’activité des CRL dépendante de NEDD8 module la dégradation de nombreux régulateurs à courte durée de vie, reliant la neddylation au contrôle des checkpoints et aux programmes transcriptionnels. Une neddylation dérégulée et une fonction des CRL altérée sont fréquemment étudiées dans le contexte de phénotypes prolifératifs et protéotoxiques, d’instabilité génomique et de remodelage des voies de signalisation observés dans divers modèles de maladies.

NEDD8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEDD8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NEDD8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEDD8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEDD8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NEDD8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEDD8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NEDD8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NEDD8 dans les cellules tumorales présentant une expression de NEDD8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.