Ndfip2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405125-ACT

NDFIP2 (Ndfip2) kodiert einen endosomalen Membran-Adaptor, der HECT-E3-Ubiquitin-Ligasen der NEDD4-Familie bindet und aktiviert und dadurch hilft, ubiquitinierte Fracht über Endozytose und lysosomenassoziierten Abbau weiterzuleiten. Über diese Interaktionen trägt Ndfip2 zur ubiquitinabhängigen Regulation der Menge von Membranproteinen, des vesikulären Transports und von Signaloutputs bei, die mit zellulären Stressantworten verknüpft sind. Die Expression von NDFIP2 wurde in immunologischen und epithelialen Kontexten untersucht, in denen die ubiquitinvermittelte Kontrolle der Dynamik von Rezeptoren und Transportern Entzündungs-, Überlebens- und Differenzierungsprogramme beeinflussen kann. Eine Fehlregulation des endolysosomalen Traffickings und von Ubiquitin-Ligase-Netzwerken ist für die Krebsbiologie und neuroimmunologische Mechanismen breit relevant, was NDFIP2 als nützlichen Knotenpunkt für pathway-fokussierte Studien stützt.

Ndfip2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NDFIP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ndfip2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NDFIP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NDFIP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ndfip2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NDFIP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ndfip2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ndfip2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NDFIP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.