NCAM/CD56 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400302-ACT

NCAM1 kodiert das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM/CD56), ein Glykoprotein der Immunglobulin-Superfamilie, das homophile und heterophile Zell-Zell-Interaktionen vermittelt und adhesionsabhängige Signalübertragung reguliert. NCAM/CD56 trägt über Signalwege unter Beteiligung von Fyn/FAK, MAPK/ERK und Rho-Familien-GTPasen zum Neuritenauswuchs, zur synaptischen Plastizität, zur Migration und zum Remodeling des Zytoskeletts bei und moduliert über Polysialylierung die Organisation der Zelloberfläche. Im Immunsystem ist NCAM/CD56 ein definierender Marker natürlicher Killerzellen und wird mit der Bildung der Immunsynapse und der Effektorfunktion in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte NCAM1-Expression oder -Glykosylierung wurde mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert und wird in der Krebsbiologie häufig untersucht, da veränderte Adhäsions- und Invasionsprogramme beteiligt sind.

NCAM/CD56 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NCAM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NCAM/CD56 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NCAM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NCAM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NCAM/CD56-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NCAM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NCAM/CD56-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NCAM/CD56-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NCAM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.