NBR1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402592-ACT

Humanes NBR1 (Neighbor of BRCA1 Gene 1) kodiert einen selektiven Autophagie-Rezeptor, der ubiquitinierte Fracht erkennt und sie über LIR-abhängige Interaktionen mit LC3-positiven Autophagosomen verknüpft. NBR1 kooperiert mit SQSTM1/p62 bei Aggrephagie, Mitophagie und der Kontrolle der Proteostase und unterstützt so den Abbau von Proteinaggregaten und geschädigten Organellen unter zellulärem Stress. Über diese Funktionen trägt NBR1 zur Regulation der angeborenen Immun-Signalgebung, zu Reaktionen auf oxidativen Stress sowie zur lysosomenabhängigen Qualitätskontrolle bei. Eine dysregulierte, NBR1-assoziierte Autophagie wurde mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, Krebsbiologie und inflammatorische Phänotypen relevant sind, was NBR1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien des autophagischen Flusses und der Ubiquitin-Signalgebung macht.

NBR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NBR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NBR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NBR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NBR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NBR1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NBR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NBR1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NBR1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NBR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.