NARC-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402445-ACT

PCSK9 kodiert die sekretierte Serinprotease NARC-1, einen zentralen posttranslationalen Regulator der Cholesterinhomöostase, indem es die Menge an LDL-Rezeptoren an der Oberfläche von Hepatozyten steuert. Durch Förderung der Internalisierung und lysosomalen Degradation von LDLR moduliert PCSK9 das Rezeptor-Recycling und beeinflusst die Aufnahme von Lipoproteinen; dabei ist es in SREBP-gesteuerte Programme des Lipidstoffwechsels eingebunden. Die Expression und Aktivität von PCSK9 stehen zudem in Wechselwirkung mit dem ER-zu-Golgi-Transport, der Verarbeitung im sekretorischen Weg sowie mit extrazellulären Rezeptor‑Ligand‑Dynamiken. Eine Fehlregulation der PCSK9-Signalgebung ist stark mit veränderten LDL-Cholesterinspiegeln im Plasma und einer erhöhten Anfälligkeit für kardiometabolische Erkrankungen assoziiert, weshalb PCSK9 häufig als Ziel in mechanistischen Studien zur Lipidregulation genutzt wird.

NARC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCSK9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NARC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCSK9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCSK9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NARC-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCSK9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NARC-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NARC-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCSK9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.