N-WASP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401440-ACT

WASL codifica la N-WASP umana, una proteina regolatrice dell’actina a domini multipli che collega la segnalazione mediata dalle GTPasi della famiglia Rho e dai fosfoinositidi alla nucleazione dell’actina ramificata mediata da Arp2/3. Coordinando il rimodellamento del citoscheletro, N-WASP sostiene processi quali l’endocitosi mediata da clatrina, la protrusione di membrana e la migrazione, la dinamica delle adesioni e l’organizzazione della sinapsi immunologica. L’attività di N-WASP integra input di segnalazione provenienti da Cdc42, da adattatori con dominio SH3 e da tirosin-chinasi per modulare l’assemblaggio dell’actina in risposta a segnali extracellulari. Una funzione disregolata di WASL/N-WASP è stata implicata in alterazioni della motilità cellulare e del comportamento invasivo, in fenotipi neuroevolutivi legati alla dinamica dell’actina sinaptica e in difetti di segnalazione delle cellule immunitarie rilevanti per l’infiammazione e le interazioni ospite–patogeno.

N-WASP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WASL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

N-WASP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WASL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WASL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di N-WASP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WASL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da N-WASP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via N-WASP nelle cellule tumorali con espressione di WASL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.