Mucin 5B/MUC5B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401077-ACT

MUC5B kodiert Muzin 5B, ein hochmolekulares, gelbildendes Muzin, das stark O-glykosyliert ist und sezerniert wird, um die viskoelastische Schleimbarriere auf den Atemwegs- und anderen mukosalen Epithelien zu bilden. MUC5B trägt zur mukoziliären Clearance bei, indem es die Hydratation des Schleims, die Quervernetzung der Polymere und das Einfangen von Pathogenen reguliert, und ist in Programme der epithelialen Differenzierung sowie in Entzündungssignale eingebunden, die die extrazelluläre Oberflächenumgebung umgestalten. Seine Expression wird durch zytokingesteuerte Signalwege sowie durch sekretorische Verarbeitungsprozesse im ER/Golgi beeinflusst, die die Muzinbiosynthese und den Export koordinieren. Fehlregulierte MUC5B-Spiegel und eine veränderte Rheologie des Schleims werden in der Forschung zu chronischen Atemwegsentzündungen und zur fibrotischen Lungenbiologie breit untersucht, weshalb MUC5B häufig ein Ziel für mechanistische Modelle der epithelialen Homöostase ist.

Mucin 5B/MUC5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MUC5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mucin 5B/MUC5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MUC5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MUC5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mucin 5B/MUC5B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MUC5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mucin 5B/MUC5B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mucin 5B/MUC5B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MUC5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.