MTMR8/9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413097-ACT

MTMR9 kodiert ein Protein aus der Myotubularin-Familie, das über Interaktionen mit katalytisch aktiven Myotubularinen an der Phosphoinositid-Signalübertragung beteiligt ist und damit das zelluläre Gleichgewicht von Phosphatidylinositol-3-phosphat und Phosphatidylinositol-(3,5)-bisphosphat beeinflusst. Über diese lipidabhängigen Signalwege werden MTMR8/9-assoziierte Komplexe mit endosomalen Transportprozessen, Membranumbau sowie der nachgeschalteten Regulation von nährstoffsensitiven und autophagiebezogenen Prozessen in Verbindung gebracht. MTMR9 wurde in genetischen und funktionellen Studien mit metabolischen Phänotypen und insulinbezogenen Signalzusammenhängen verknüpft; zudem wurde eine veränderte Expression in krankheitsassoziierten Datensätzen, einschließlich Krebs, berichtet. Diese Eigenschaften machen MTMR9 zu einem nützlichen Ziel, um die phosphoinositidabhängige Kontrolle der Vesikeldynamik und der Regulation zellulärer Zustände zu untersuchen.

MTMR8/9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MTMR9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MTMR8/9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MTMR9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MTMR9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MTMR8/9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MTMR9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MTMR8/9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MTMR8/9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MTMR9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.