Mrf-1 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-406689-ACT-2

Das humane ARID5A (Mrf-1) kodiert einen RNA-bindenden Regulator mit AT-reicher Interaktionsdomäne, der die Expression entzündungsrelevanter Gene moduliert, indem er ausgewählte Zytokin-mRNAs – darunter IL6 – stabilisiert und damit angeborene und adaptive Immunantworten prägt. ARID5A integriert Signale nachgeschaltet von TLR/IL-1R- und NF-κB-Signalwegen und wirkt RNase-vermittelten Abbauprogrammen entgegen, um Ausmaß und Dauer der Immunaktivierung zu steuern. Eine dysregulierte ARID5A-Aktivität wurde mit abweichender Zytokinproduktion und immunvermittelter Pathologie in Kontexten wie Autoimmunität, chronischer Entzündung und tumorassoziierter Entzündung in Verbindung gebracht. Das Gene Editing von ARID5A unterstützt mechanistische Studien zur posttranskriptionellen Kontrolle, zur Differenzierung und Aktivierung von Immunzellen sowie zur Pfadwegkartierung von Zytokinnetzwerken in humanen Zellmodellen.

Mrf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARID5A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mrf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARID5A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARID5A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mrf-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARID5A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mrf-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mrf-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARID5A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.