Plasmide CRISPR d'Activation (h) MRCKβ: sc-403169-ACT

CDC42BPB code la protéine bêta se liant à Cdc42 apparentée à la kinase de la dystrophie myotonique (MRCKβ), une kinase sérine/thréonine qui agit en aval des GTPases de la famille Rho, en particulier CDC42, pour réguler la contractilité actine–myosine et le remodelage du cytosquelette. MRCKβ phosphoryle des substrats tels que la chaîne légère de la myosine et LIMK, influençant la formation des fibres de stress, la dynamique membranaire, la polarité cellulaire et la migration directionnelle. Par ces fonctions, CDC42BPB fait le lien entre la signalisation des GTPases Rho et des voies contrôlant le renouvellement des adhésions et les changements morphogénétiques. Une activité de MRCKβ dérégulée et une expression modifiée de CDC42BPB ont été associées à des programmes aberrants de motilité cellulaire, pertinents pour des modèles d’invasion et de métastases cancéreuses, ainsi qu’à des contextes plus larges de remodelage tissulaire et de microenvironnements inflammatoires.

MRCKβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDC42BPB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MRCKβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDC42BPB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDC42BPB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MRCKβ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDC42BPB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MRCKβ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MRCKβ dans les cellules tumorales présentant une expression de CDC42BPB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.