MIP-1α CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h): sc-417845

Übersicht

CCL3L3 kodiert das Makrophagen-Entzündungsprotein‑1α (MIP‑1α), ein CC‑Chemokin, das vor allem über CCR1 und CCR5 signalisiert und dadurch Chemotaxis sowie die Aktivierung von Monozyten/Makrophagen, T‑Zellen und weiteren Leukozytensubpopulationen antreibt. MIP‑1α trägt zur Rekrutierung von Leukozyten, zur Verstärkung von Zytokinnetzwerken und zur Modulation angeborener und adaptiver Immunantworten bei und ist in NF‑κB‑ und MAPK‑gekoppelte Entzündungssignalwege eingebunden. Als Teil der Chemokinachse, die das Trafficking von Immunzellen steuert, wird CCL3L3 häufig im Kontext entzündlicher Mikroumgebungen und immunologischer Dysregulation untersucht. Seine Aktivität ist relevant für Mechanismen chronischer Entzündung, infektionsassoziierter Immunität sowie Tumor‑Immun‑Interaktionen, bei denen CCR5‑abhängige Migration und Zell‑Zell‑Kommunikation entscheidend sind.

MIP-1α CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des CCL3L3-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des CCL3L3-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das MIP-1α HDR-Plasmid (h) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte CCL3L3 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem MIP-1α CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das CCL3L3 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des CCL3L3-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf CCL3L3 Exon(e) abzielt, die für die MIP-1α Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.