MIB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404769-ACT

Humanes **MIB1** kodiert **Mindbomb E3 Ubiquitin-Protein-Ligase 1**, eine E3-Ubiquitin-Ligase, die die Ubiquitinierung und Endozytose von Notch-Liganden wie **JAG1** und **DLL**-Proteinen fördert und dadurch eine produktive Aktivierung des Notch-Rezeptors ermöglicht. Über die Regulation des Ligandentransports sowie der Signalgebungskompetenz des Rezeptor‑Ligand‑Komplexes beeinflusst MIB1 Zellschicksalsentscheidungen, Differenzierung und Gewebemusterbildung in Entwicklungs- und Homöostasekontexten. Die MIB1-Aktivität ist mit ubiquitinabhängiger Proteostase und endozytischen Sortierwegen verknüpft und formt die transkriptionellen Outputs nachgeschaltet der Notch-Signalübertragung. Eine Fehlregulation der MIB1/Notch-Achse wurde mit veränderter Neurogenese, Phänotypen der kardiovaskulären Entwicklung und onkogenen Signalzuständen in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien in diversen Zellmodellen motiviert.

MIB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MIB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MIB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MIB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MIB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MIB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MIB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MIB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MIB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MIB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.