MGMT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400720-ACT

MGMT (O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase) ist ein konserviertes DNA-Reparaturprotein, das Alkyladdukte an der O6-Position von Guanin über einen Mechanismus der direkten Umkehr entfernt. Dadurch wird die Genauigkeit der Basenpaarung wiederhergestellt und die Mutagenese begrenzt. Als Suizidenzym, das die Alkylgruppe auf ein Cystein im aktiven Zentrum überträgt, beeinflusst MGMT die zellulären Antworten auf endogenen und exogenen Alkylierungsstress und ist in Programme zur Genomstabilität eingebunden, die den Zellzyklusverlauf und die DNA-Schadenssignalgebung prägen. Unterschiede in der MGMT-Expression und der Promotorregulation wurden in mehreren Krankheitskontexten mit einer veränderten Anfälligkeit für Mutationsakkumulation und genomische Instabilität in Verbindung gebracht, was MGMT zu einem zentralen Ansatzpunkt für die Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität macht. MGMT wird zudem häufig als funktioneller Readout in Signalwegen genutzt, die die Toleranz gegenüber genotoxischem Stress und die epigenetische Kontrolle der Expression von DNA-Reparaturgenen steuern.

MGMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MGMT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MGMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MGMT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MGMT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MGMT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MGMT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MGMT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MGMT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MGMT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.